lunes, 8 de diciembre de 2014
UREA
Uso
Se emplea
para la diferenciación de bacterias por medio de la utilización de la urea como
única fuente de carbono.
Principio
La enzima
ureasa hidroliza la urea en amoníaco y anhídrido carbónico, ante la variación
de pH por la alcalinización, el indicador rojo de fenol, vira de amarillo claro
a ligeramente rosado o rosa mexicano.
Se utiliza
solamente para la detección de la actividad de la ureasa en especies del género
Proteus que dan la prueba positiva después de una incubación de 8 h. Si los
nutrientes suministrados por el extracto de levadura se consumen antes de que
la bacteria muestre un crecimiento aceptable no podrá determinarse con
exactitud su capacidad de hidrolizar la urea. Si un microorganismo es capaz de
hidrolizar la urea, pero no de utilizar el amoníaco como fuente de nitrógeno,
no se produce crecimiento y es posible observar un resultado falso negativo. No
se recomienda para las bacterias con reacción de ureasa retardada. Sembrar el
medio de cultivo con el cultivo puro de ensayo. Incubar 24 – 48 h a
35ºC. En ocasiones hasta 72 horas.
Se utiliza
para la valoración de la producción de ureasa por algunas enterobacterias. Este
medio contiene glucosa, peptona, urea y rojo de fenol. Las bacterias que
producen ureasa a partir de la urea dan lugar al carbonato de amonio y el
indicador se vuelve rojo púrpura. Obsérvese en la tabla de reacciones
bioquímicas que solo el género Proteus da esta reacción positiva.
Mac Conkey Agar.
Mac
Conkey Agar.
Este medio se utiliza para el
aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y
anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no,
lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la
familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.
Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares.
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores
de lactosa producen colonias incoloras.
Fórmula
(en gramos por litro)
|
Instrucciones
|
|
Peptona
|
17.0
|
Suspender 50 g del polvo por litro de agua
destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar suavemente y
hervir 1 a 2 minutos hasta disolver. Esterilizar en autoclave a 121°C durante
15 minutos.
|
Pluripeptona
|
3.0
|
|
Lactosa
|
10.0
|
|
Mezcla de sales biliares
|
1.5
|
|
Cloruro de sodio
|
5.0
|
|
Agar
|
13.5
|
|
Rojo neutro
|
0.03
|
|
Cristal violeta
|
0.001
|
|
pH final:
7.1 ± 0.2
|
||
Siembra
- Sembrar en superficie.
- Utilizando la técnica de Pour Plate: sembrar 1 ml de muestra y agregar aproximadamente 15 ml de medio de cultivo fundido y enfriado a 45-50 ºC.
- Sembrar en superficie.
- Utilizando la técnica de Pour Plate: sembrar 1 ml de muestra y agregar aproximadamente 15 ml de medio de cultivo fundido y enfriado a 45-50 ºC.
Incubación
Durante 18-48 horas, a 35-37 ºC, en atmósfera aeróbica
Durante 18-48 horas, a 35-37 ºC, en atmósfera aeróbica
Resultados
Microorganismos
|
Colonias
|
Escherichia
coli ATCC 25922
|
Rojas con
halo turbio
|
Klebsiella
pneumoniae ATCC 700603
|
Rosadas
mucosas
|
Salmonella
typhimurium ATCC 14028
|
Incoloras,
transparentes
|
Shigella
flexneri ATCC 12022
|
Incoloras,
transparentes
|
Proteus
mirabilis ATCC 43071
|
Incoloras,
transparentes
|
Enterococcus
faecalis ATCC 29212
|
Diminutas,
incoloras, opacas
|
Características
del medio
Medio preparado: rojo púrpura
Medio preparado: rojo púrpura
Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC
Kligler Hierro Agar.
Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiología de alimentos
para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa
y lactosa, y a la producción de ácido sulfhídrico.
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteina, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agar es el agente solidificante.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.
En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteina, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agar es el agente solidificante.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.
Siembra
A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, sembrar el medio de cultivo, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.
A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, sembrar el medio de cultivo, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.
Incubación
A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis.
A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis.
Resultados
Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa.
Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa.
Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, y lactosa.
Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares.
La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas.
El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.
|
Microorganismo
|
Pico/Fondo
|
Producción de gas
|
Producción de
ácido sulfhídrico
|
|
E.
coli ATCC 25922
|
A/A
|
+
|
-
|
|
K.
pneumoniae ATCC700603
|
A/A
|
+
|
-
|
|
P.
mirabilis ATCC 43071
|
K/A
|
+
|
+
|
|
S.
typhimurium ATCC 14028
|
K/A
|
-
|
+
|
|
S.
enteritidis ATCC 13076
|
K/A
|
+
|
+
|
|
S.
flexneri ATCC 12022
|
K/A
|
-
|
-
|
|
P.
aeruginosa ATCC 27853
|
K/K
|
-
|
-
|
Interpretación de
resultados
Se debe examinar la
parte superior e inferior del medio y valorar la coloración
a) En el extremo superior
Rojo.- No fermentan
lactosa, sacarosa o ambas.
Amarillo.- Fermenta lactosa, sacarosa o ambas.
Amarillo.- Fermenta lactosa, sacarosa o ambas.
Explicación: El color amarillo indica un pH bajo debido a la
producción de ácidos en grandes cantidades por la fermentación de la lactosa
y/o sacarosa. Si la bacteria no fermenta lactosa y/o sacarosa la
producción de ácidos es nula o, en caso de las enterobacterias, mínima (ya que
todas fermentan la glucosa, generando ácidos en pequeñas
cantidades) aunque no lo suficiente para contrarrestar la alcalinidad del
medio, la cual se manifiesta con un intenso color rojo.
b) Extremo inferior.
Rojo.- Sin fermentación, la bacteria es un aerobio obligado.
Amarillo.- Fermentación, la bacteria es un aerobio facultativo.
Negro.- Producción de
H2S.
Grietas, burbujas o
elevación del medio.- Producción de gas.
Explicación: La coloración sigue el mismo patrón, indicando el pH
en base a la fermentación de carbohidratos. La presencia de un color rojo a
este nivel, no sólo nos dice que la bacteria no fermenta lactosa y sacarosa,
además es indicativo de que no fermenta glucosa y por tanto necesita oxígeno
para oxidar éstos carbohidratos y obtener energía de ellos, siendo así un
microorganismo aerobio obligado.
La presencia de coloración amarilla nos indica fermentación de carbohidratos, aunque sea sólo de glucosa (si el otro extremo es rojo) y esta función metabólica es típica de anaerobios facultativos.
La presencia de coloración amarilla nos indica fermentación de carbohidratos, aunque sea sólo de glucosa (si el otro extremo es rojo) y esta función metabólica es típica de anaerobios facultativos.
La bacteria puede reducir el SO4 (sulfato
ferroso) a H2S (ácido sulfhídrico), este se combinará con
el Fe (hierro) para formar FeS (sulfuro de hierro) el cual proporciona un
aspecto negro al extremo inferior. La producción de gas dentro del agar
provocará grietas, burbujas o desplazamiento del mismo hacia arriba.
Estafilococo Medio 110.
Estafilococo Medio 110.
Es un medio selectivo para
el aislamiento y diferenciación presuntiva de estafilococos, en base a la
producción
de pigmentos, la fermentación de manitol y la hidrólisis de gelatina, a partir de alimentos y otras muestras.
FUNDAMENTO
Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicación alimentaria, y para su aislamiento, pueden usarse distintos medios sólidos selectivos: Baird Parker Medio (B02-141-05/06), Manitol Salado Agar (B02-118-05/06), o Estafilococo Medio 110 (B02-105-05/06). En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la tripteína aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato de la enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbono fermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentración, para inhibir el desarrollo de la flora acompañante excepto Staphylococcus spp., lográndose así un medio selectivo para el desarrollo de estos microorganismos. Las ventajas de este medio por sobre los otros mencionados anteriormente, es que permite, en la misma placa, obtener pruebas de identificación presuntiva de especie como ser: desarrollo de pigmentos, fermentación de manitol e hidrólisis de la gelatina.
de pigmentos, la fermentación de manitol y la hidrólisis de gelatina, a partir de alimentos y otras muestras.
FUNDAMENTO
Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicación alimentaria, y para su aislamiento, pueden usarse distintos medios sólidos selectivos: Baird Parker Medio (B02-141-05/06), Manitol Salado Agar (B02-118-05/06), o Estafilococo Medio 110 (B02-105-05/06). En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la tripteína aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato de la enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbono fermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentración, para inhibir el desarrollo de la flora acompañante excepto Staphylococcus spp., lográndose así un medio selectivo para el desarrollo de estos microorganismos. Las ventajas de este medio por sobre los otros mencionados anteriormente, es que permite, en la misma placa, obtener pruebas de identificación presuntiva de especie como ser: desarrollo de pigmentos, fermentación de manitol e hidrólisis de la gelatina.
|
Fórmula
(en gramos por litro)
|
Instrucciones
|
|
|
Extracto
de levadura
|
2.5
|
Suspender
149 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar
calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Esterilizar en autoclave
durante 15 minutos a 121°C. Verter en placas y mezclar para dispersar el
precipitado.
|
|
Tripteína
|
10.0
|
|
|
Gelatina
|
30.0
|
|
|
Lactosa
|
2.0
|
|
|
D-Manitol
|
10.0
|
|
|
Cloruro
de sodio
|
75.0
|
|
|
Fosfato
dipotásico
|
5.0
|
|
|
Agar
|
15.0
|
|
|
pH
final: 7.0 ± 0.2
|
||
Siembra
Directa, en superficie, por estriado o por extensión.
Incubación
Durante 48 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis.
Resultados
Observar las características de las colonias y realizar las pruebas de identificación de microorganismos.
1-Fermentación de manitol: agregar unas gotas de púrpura de bromocresol a las zonas donde se encuentran las colonias sospechosas y en una zona de la placa donde no hay desarrollo bacteriano. Comparar el color desarrollado entre estas dos zonas.
Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona de crecimiento bacteriano. El medio sin desarrollo de microorganismos permanece sin cambio.
Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimiento bacteriano y la zona sin inocular.
2-Hidrólisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solución saturada de sulfato de amonio y colocar en estufa, a 35-37 ºC, en aerobiosis durante 10 minutos.
Positiva: halo transparente alrededor de las colonias.
Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.
Directa, en superficie, por estriado o por extensión.
Incubación
Durante 48 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis.
Resultados
Observar las características de las colonias y realizar las pruebas de identificación de microorganismos.
1-Fermentación de manitol: agregar unas gotas de púrpura de bromocresol a las zonas donde se encuentran las colonias sospechosas y en una zona de la placa donde no hay desarrollo bacteriano. Comparar el color desarrollado entre estas dos zonas.
Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona de crecimiento bacteriano. El medio sin desarrollo de microorganismos permanece sin cambio.
Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimiento bacteriano y la zona sin inocular.
2-Hidrólisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solución saturada de sulfato de amonio y colocar en estufa, a 35-37 ºC, en aerobiosis durante 10 minutos.
Positiva: halo transparente alrededor de las colonias.
Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.
|
Microorganismo
|
Pigmento
|
Fermentación
de manitol
|
Hidrólisis
de la gelatina
|
Prueba
de la coagulasa
|
|
S.
aureus ATCC 25923
|
+
|
+
|
+
|
+
|
|
S.
aureus ATCC 6538
|
+
|
+
|
+
|
+
|
|
S.
epidermidis ATCC 14990
|
-
|
-
|
+
|
-
|
Notas:
“Realización de la Prueba de la coagulasa”: agregar a 0,5 ml de plasma heparinizado (preferentemente de conejo o humano), igual volumen de un cultivo de 24 horas en Cerebro Corazón Infusión (B02-146-05/06), obtenido a partir de las colonias sospechosas. Incubar a 35-37 °C durante 2 a 3 horas, en aerobiosis. Los estafilococos coagulasa positivos forman un coágulo antes de ese período.
“Realización de la Prueba de la coagulasa”: agregar a 0,5 ml de plasma heparinizado (preferentemente de conejo o humano), igual volumen de un cultivo de 24 horas en Cerebro Corazón Infusión (B02-146-05/06), obtenido a partir de las colonias sospechosas. Incubar a 35-37 °C durante 2 a 3 horas, en aerobiosis. Los estafilococos coagulasa positivos forman un coágulo antes de ese período.
Limitaciones
-Algunas cepas de Enterococcus faecalis, fermentadoras de manitol, pueden desarrollar en este medio.
-Para realizar la prueba de la coagulasa, se aconseja subcultivar las colonias sospechosas en medios sólidos o líquidos no selectivos, por ejemplo: Agar Nutritivo, Infusión Cerebro Corazón, Triptosa Fosfato Caldo, debido a que si se realiza directamente de este medio de cultivo, puede afectarse la detección por el alto contenido de cloruro de sodio.
-Algunas cepas de Enterococcus faecalis, fermentadoras de manitol, pueden desarrollar en este medio.
-Para realizar la prueba de la coagulasa, se aconseja subcultivar las colonias sospechosas en medios sólidos o líquidos no selectivos, por ejemplo: Agar Nutritivo, Infusión Cerebro Corazón, Triptosa Fosfato Caldo, debido a que si se realiza directamente de este medio de cultivo, puede afectarse la detección por el alto contenido de cloruro de sodio.
Características
del medio
Medio preparado: ámbar claro, opalescente con precipitado.
Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
Medio preparado: ámbar claro, opalescente con precipitado.
Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
|
Presentación
|
|
|
x
100g :Código: B02-105-05
|
x
500g :Código: B02-105-06
|
|
AGAR ESTAFILOCOCOS NO. 110
|
|
USO:
El Agar Estafilococos No.
110 es utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos en base
a la fermentación de manitol, la formación de pigmento y la hidrólisis de
gelatina.
FÓRMULA: (aproximada en
g/L)
|
Gelatina Bacteriológica
|
30.0 g
|
Lactosa
|
2.0 g
|
|
Extracto de Levadura
|
2.5 g
|
D- Manitol
|
10.0 g
|
|
Peptona de Caseína
|
10.0 g
|
Cloruro de Sodio
|
75.0 g
|
|
Fosfato dipotásico
|
5.0 g
|
Agar Bacteriológico
|
15.0 g
|
|
pH 7.0 ± 0.2
|
|
|
|
PREPARACIÓN:
Método
Suspender 149 g del medio en un litro de agua
purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir
durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121 °C (15 libras de presión)
durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50 °C y vaciar en
placas de Petri estériles.
Procedimiento
Sembrar las placas por el método de estría e
incubarlas a 35 ± 2 °C durante 24 a 48 horas. Proceder a la identificación.
PRESENTACIONES:
Medio deshidratado: Frasco 450 g y 500 g,
Caja c/20 sobres p/1 litro, Cubeta 5 kg y 10 kg.
Medio preparado: Paquete con 10 placas.
E.M.B.
E.M.B. Agar.
Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.
Fundamento
Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.
SiembraEn superficie, por estriado a partir de un inóculo poco denso, para obtener colonias aisladas.
En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.
En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.
IncubaciónDe 24 a 48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.
Resultados
Resultados
Microorganismos
|
Tipo de Colonia
|
Escherichia coli ATCC 25922
|
Verdosas con brillo metálico y centro negro azulado
|
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
|
Mucosas, rosa púrpura, confluentes
|
Proteus mirabilis ATCC 43071
|
Incoloras
|
Enterococcus faecalis ATCC 29212
|
Incoloras, pequeñas, puntiformes
|
Shigella flexneri ATCC 12022
|
Incoloras
|
Salmonella typhimurium ATCC 14028
|
Incoloras
|
Características del medio: Placas preparadas: color púrpura.
La esterilización del medio de cultivo reduce el azul de metileno al color naranja. El color púrpura se restaura por agitación. La presencia de un precipitado en el medio esterilizado es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo.
Almacenamiento:Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
Almacenamiento:Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
EMB (Aislamiento de organismos gram negativo, familia
Enterobacteriaceae) Indicadores Azul de metileno y eosina.
|
Características de medio y colonias.
|
Escherichia coli.
|
Citrobacter ssp.
|
C. Albicans Clamidosporas.
Salmonella, Shigella
|
Enterococcus
|
Acinetobacter
|
|
Lactosa.
|
+
|
+
|
-
|
-
|
|
|
Sacarosa.
|
+
|
+
|
-
|
-
|
|
|
Glucosa
|
+
|
+
|
|||
|
Brillo metálico.
|
+
|
+
|
-
|
||
|
Centro grande y obscuro con periferia
azulada o rosada.
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
|
Colonias rosadas y puntiformes.
|
-
|
-
|
+
|
-
|
.
|
|
Colonias puntiformes y transparente.
|
-
|
-
|
-
|
+
|
-
|
|
Colonias de azul lavanda.
|
-
|
-
|
-
|
-
|
+
|
|
Siembra en profundidad.
|
+
|
+
|
+
|
||
|
Siembra en superficie.
|
+
|
+
|
-
|
-
|
-
|
|
Bacterias Gram -
|
Suscribirse a:
Entradas (Atom)