CITRATO DE SIMMONS

El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, un compuesto orgánico simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de los ácidos tricarboxilicos. Generalmente los microorganismos que emplean el citrato como única fuente de carbono, utilizan sales de amonio como única fuente de nitrógeno. El metabolismo del citrato realizado, por algunas bacterias se realiza por el ciclo de Krebs y requiere el desdoblamiento del citrato por la enzima citritasa (citrato-oxalacetato-liasa o citrato desmolasa) en presencia de  magnesio o manganeso y de transportadores como citrato permeasas.

La citritasa actúa sobre el citrato produciendo ácido oxalacetico y acetato; productos que son convertidos enzimáticamente a piruvato y dióxido de carbono. Durante esta reacción el medio comienza a alcalinizarse por el CO₂ que se genera, el cual se combina con el agua y el sodio para formar Carbonato un producto alcalino, este carbonato da la alcalinidad que produce el cambio de color del indicador de pH del medio de verde a azul Prusia oscuro (indicador: azul de bromo timol, amarillo a pH< de 6.0 y azul a pH > de 7.6). El medio incluye citrato como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno.

Técnica

Inocular el tubo con agar citrato de Simmons realizando siembra por estría tomando una colonia del microorganismo en estudio. Incubar a 37 grados C por 24 horas.

Interpretación

El desarrollo de un color azul intenso  en 24-48 horas indica una prueba positiva y revela que el microorganismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato en el medio con la formación de productos alcalinos. La prueba también es positiva en ausencia de color azul si existe crecimiento del microorganismo a lo largo de la estría de inoculación.

Fundamento

Esta prueba nos permite diferenciar un grupo de bacterias que son capaces de crecer con citrato como única fuente de carbono y sales amónicas inorgánicas como única fuente de nitrógeno, provocando la alcalinización del medio.El medio a utilizar es agar Citrato de Simons, que contiene citrato de sodio, fosfato de amonio y azul de bromotimol como indicador de pH.

Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con el metabolismo del citrato, generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del mismo de verde a azul

Agar TSI(Triple azúcar hierro)

Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la determinación de posible ácido sulfhídrico.

El agar TSI es un medio diferencial que determina tanto la fermentación de los hidratos de carbono y la producción de ácido sulfhídrico. Las bacterias pueden utilizar cualquiera de los sustratos incorporados en el medio y ser metabolizados, características que son utilizadas para la diferenciación de éstas, principalmente para las Enterobacterias.

Este medio contiene lactosa con una concentración de 1% y glucosa 0.1%, lo cual permite la observación de la fermentación de uno o de ambos carbohidratos por parte de las bacterias, además de la producción de gas y de ácido sulfhídrico.

La fermentación es un proceso que se lleva a cabo en condiciones aeróbicas (pico de flauta) y anaeróbicamente (capa inferior). En el pico de flauta la glucosa (monosacárido) es catabolizada inicialmente por medio del ciclo anaeróbico de Embden-Meyerhof, utilizado tanto por los aerobios como por los anaerobios para dar ácido pirúvico, y posteriormente éste será degradado a través del ciclo de Krebs para dar CO₂, H₂O y energía.

Por otra parte la lactosa (disacárido) será primero degradada a sus monosacáridos correspondientes (glucosa y galactosa). 

El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y una concentración 10 veces mayor de lactosa. Las Enterobacterias y los fermentadores de glucosa comienzan metabolizando este azúcar, ya que las enzimas que utilizan la glucosa están presentes como constituyentes de las bacterias, y éstas pueden obtener mayor energía por utilización del azúcar más simple.

Todos los otros carbohidratos deben ser convertidos en glucosa para entrar en el ciclo de Embden-Meyerhof. La utilización de la glucosa se realiza en forma aerobia sobre la estría, donde el oxígeno presente actúa como aceptor terminal de electrones y en la parte terminal de la columna en condiciones de anaerobiosis. Una vez que una bacteria fermentadora de glucosa ha reducido toda la glucosa disponible a piruvato, comenzará a metabolizar el piruvato a través del ciclo aeróbico de Krebs (sobre la estría), formando productos finales ácidos. El ácido en el medio hace virar el amarillo del indicador de pH, rojo de fenol. Entonces, luego de 6 horas de incubación, la zona de la estría y el fondo del tubo inoculado con un fermentador de glucosa tendrán un color amarillo. Si el microorganismo no fermenta la glucosa, el fondo permanecerá rojo (indicando que no hay variación del pH) o se alcalinizará (lo que puede visualizarse por un color rojo algo más intenso que del medio original), demostrando que la bacteria no es miembro de la familia Enterobacteriaceae.

Después de haber agotado la cantidad limitada de glucosa, una bacteria con capacidad para utilizar la lactosa o sacarosa comenzará a degradarlas. Como el medio contiene 10 veces más lactosa que glucosa, las bacterias encontrarán sustrato suficiente para continuar la formación de productos finales ácidos. Luego 18 – 24 horas de incubación todo el medio TSI permanecerá de color amarillo. Esta reacción se denomina ácido sobre ácido (A/A) y el organismo se identifica como un fermentador de lactosa. La producción de gas provocará la ruptura de la columna de agar o la empujará hacia la parte superior, de modo que un fermentador de lactosa que produce gas dará una reacción A/A más gas.

Interpretación

1. Rojo en pico de flauta: alcalino; degradación aeróbica de glucosa. Amarillo en capa   profunda: ácido; degradación anaeróbica de la glucosa.

2. Amarillo en pico: ácido Amarillo en capa profunda: ácido

3. Rojo en pico de flauta: alcalino Sin cambio de color en capa profunda: alcalina.

4. Producción de H₂S: precipitado negro

5. Producción de gases: Producción de burbujas, descomposición del medio, ligera muesca del medio sobre el costado del tubo o desplazamiento del medio del fondo, dejando un espacio libre.

Forma de reporte de resultados.

                 1.    K / A (Fermentación de glucosa solamente)

                 2.    A / A (Fermentación de glucosa y lactosa)

                 3.    K / K (No fermentación de glucosa y lactosa).

Los resultados se escriben siempre siguiendo un patrón. Primero la reacción del pico de flauta seguida por la reacción de la capa profunda, separadas por una barra.

ADN Y ARN

Las actividades exonucleasas de la DNA polimerasa:

La ADN polimerasa son proteínas que además de las actividades polimerasas que poseen, tienen también actividades exonucleasas. Los ADN pol de tipo I terminán la replicación, eliminando los fragmentos de Okazaki y corrigiéndo los errores producidos por la polimerasa de tipo 3. Para realizar ésta actividad, una ADN polimerasa de tipo I posee dos tipos de actividades exonucleasas. Una actividad exonucleasa 5' ---> 3' que elimina todos los nucleótidos (ribonucleótido o desoxiribonucleótido) situados al final del cebador. Esta actividad es muy útil para la reacción en cadena en tiempo real y en la técnica del marcado de sondas denominada translación nick (nick translation). La otra actividad (3' ---> 5') es la actividad "proofreading", osea la correción de errores. Esta actividad no existe en los procariotas (bacterias), solamente en los eucariotas y archaea. Las polimerasas que poseen ésta actividad exonucleasas producen menos faltas pero son sustancialmente más lentas.

Por ejemplo la Taq polimerasa de Thermus aquaticus ajusta ó añade 500-1000 nt por minuto a 72°.

Las ADN polimerasas termoresistentes fueron aisladas de organismos resistentes a temperaturas elevadas, bacteria s ó archeae. Ellas permiten trabajar a temperaturas que permiten el aparamiento perfecto del cebador al molde. Estas polimerasas pueden resistir temperaturas de ± 70 donde pueden solamente perder hasta el 40% de ésta actividad por hora.

Polimerasa: enzima exonuclesa

TECNICAS DE DNA RECOMBINANTE

ADN recombinante es una molécula que proviene de la unión artificial de dos fragmentos de ADN. Por lo tanto, la tecnología de ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. De esta manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña. 

Procesamiento del RNAm

Un poco después de que se inicia la transcripción, se realiza una

modificación del transcrito primario consistente en la adición de una caperuza (Cap) sobre el extremo 5’. Esta caperuza, formada por la adición de un residuo de 7’-metil guanosina enlazado a traves de un enlace trifosfato, proteje al RNAm de la actividad de exonucleasas y aparentemente promueve su traducción en la maquinaria ribosoma.

Corte y empalme de intrones

El proceso más dramático y complejo que debe sufrir el RNAhn, antes de ser RNAm, es la supresión de los intrones. Durante este proceso, que se ha llamado ayuste o corte y empalme (splicing), cada intron es eliminado en una configuración desusada llamada “lariat” o lazo. 

Los Microorganismos

Hasta los tiempos modernos, las infecciones por microorganismos como las bacterias, hongos, parásitos y virus eran la principal causa de muerte del ser humano, y lo siguen siendo en entornos con escasos recursos.

Las bacterias son microorganismos procariotas que presentan un tamaño de unos pocos micrómetros y diversas formas incluyendo filamentos, esferas (cocos), barras (bacilos), sacacorchos (vibrios) y hélices (espirilos).

Las bacterias son los organismos más abundantes del planeta. Se encuentran en todos los hábitats terrestres y acuáticos; crecen hasta en los más extremos como en los manantiales de aguas calientes y ácidas, en desechos radioactivos, en las profundidades tanto del mar como de la corteza terrestre. Algunas bacterias pueden incluso sobrevivir en las condiciones extremas del espacio exterior.

Solo una pequeña fracción de las bacterias causan enfermedades en los seres humanos: de unas 151500 especies encontradas, solo 538 (un 0,36 %) son patógenas. Aún así son una de las principales causas de enfermedad y mortalidad humana, causando infecciones tales como el tétanos, la fiebre tifoidea, la difteria, la sífilis, el cólera, intoxicaciones alimentarias, la lepra y la tuberculosis. 

TRATAMIENTO

Las infecciones bacterianas se pueden tratar con antibióticos, que se clasifican como bactericidas, si matan bacterias, o como bacteriostáticos, si solo detienen el crecimiento bacteriano. Existen muchos tipos de antibióticos y cada tipo inhibe un proceso que difiere en el patógeno con respecto al huésped. Ejemplos de antibióticos de toxicidad selectiva son el cloranfenicol y la puromicina, que inhiben el ribosoma bacteriano, pero no el ribosoma eucariota que es estructuralmente diferente. Los antibióticos se utilizan para tratar enfermedades humanas y en la ganadería intensiva para promover el crecimiento animal

PARASITO

• Se llama parasitismo a la relación que se establece entre dos especies, ya sean vegetales o animales. En esta relación, se distinguen dos factores biológicos: el parásito y el huésped. El parásito vive a expensas de la otra especie, a la que se le denomina huésped.
• El parásito compite por el consumo de las sustancias alimentarias que ingiere el huésped, o como el caso del anquilostoma, éste se nutre de la sangre del huésped, adheriéndose a las paredes del intestino.

TIPOS DE PARASITO

Existen formas parásitas en muchos grupos biológicos. Entre estos están:

• los virus, que son parásitos obligados
• las bacterias
• los hongos
• las plantas
• los protistas (como los api complejos o algunas algas rojas), y muchos animales.

Atendiendo al lugar ocupado en el cuerpo del hospedador, los parásitos pueden clasificarse en:

• ectoparásitos: viven en contacto con el exterior de su hospedador (por ejemplo la pulga)
• endoparásitos: viven en el interior del cuerpo de su hospedador (por ejemplo una tenia o una triquina)
• mesoparásitos: poseen una parte de su cuerpo mirando hacia el exterior y otra anclada profundamente en los tejidos de su hospedador. En algunos casos extremos de mesoparásitos de peces (copepodos pennellidae), pueden tener la cabeza introducida en el corazón de su hospedador y extenderse por las arterias hasta las branquias, o perforar la cavidad visceral.

VIRUS

Los virus infectan todos los tipos de organismos, desde animales y plantas, hasta bacterias y arqueas. Los virus son demasiado pequeños para poder ser observados con la ayuda de un microscopio óptico, por lo que se dice que son submicroscópicos; aunque existen excepciones entre los Virus nucleocitoplasmáticos de ADN de gran tamaño, tales como el Megavirus chilensis, el cual se logra ver a través de microscopía óptica.

EFECTOS EN LA CELULA HUESPED

La variedad de efectos estructurales y bioquímicos de los virus sobre las células huésped es grande. Reciben el nombre de «efectos citopáticos».La mayoría de infecciones víricas acaban provocando la muerte de la célula huésped, entre cuyas causas están la lisis de la célula, las alteraciones de la membrana superficial de la célula y la apoptosis. A menudo, la muerte de la célula es causada por el paro de sus actividades normales debido a la supresión por proteínas específicas del virus, que no son todas componentes de la partícula vírica.

RESPUESTA INMUNE DEL HUESPED

La primera línea de defensa del organismo contra los virus es el sistema inmunitario innato. Éste incluye las células y otros mecanismos que defienden al organismo de la infección de una forma no específica. Esto significa que las células del sistema innato reconocen y responden a los agentes patógenos de una manera genérica, pero, a diferencia del sistema inmune adaptativo, no confieren protección de larga duración o inmunidad.

Cultivos

CULTIVO PURO Y CULTIVO MIXTO

Los cultivos puros se obtienen habitualmente de cultivos mixtos (que contienen varias especies), por métodos que separan las células de modo que, cuando se multiplican, cada una formará una colonia distinta, que luego puede usarse para establecer nuevos cultivos con la seguridad de que tendrán sólo un tipo de organismo. Los cultivos puros se obtienen más fácilmente si el medio de crecimiento empleado para el cultivo mixto original favorece el desarrollo de un organismo con exclusión de otros.

Cultivos Mixtos Clásicos

Oliver Weiss

Cultivos Mixtos Clásicos

Resumen:   El cultivo mixto consiste en plantar distintas variedades en estrecha vecindad, basándose en el antiguo concepto de “plantas compañeras”. El cultivo mixto permite que las cualidades naturales de las diferentes especies se complementen.

A continuación presento algunos ejemplos:

1.     Zanahoria con puerro, o con cebolla o ajo, mezclando en la línea: se protegen mutuamente de la mosca de cebolla y de la mosca de zanahoria.

2.     Abas y/o judías con ajedrea anual (Satureja hortensis), mezclando en la línea: favorece el crecimiento, mejora el aroma, y protege las judías de la pulga negra.

3.     Coles con nabos, alternando en la línea, y tomates en la siguiente fila: debido al fuerte olor del tomate muy efectivo contra la mariposa blanca del col.

4.     Tomates al lado de col.

5.     Lechuga con perifolio (Anthriscus cerefolium): espanta las hormigas y caracoles, pulgón y mildiú por su olor.

6.     Ajo entre fresas evita enfermedades por hongos

7.     Pepinos con albahaca para evitar mildiú.

8.     Perejil con tagetes

9.     Patatas tempranas con comino y cilantro

10. Arboles pequeños con capuchino: contra pulgón y ayuda la salud de las plantas

La plantación contigua ofrece muchas ventajas. Las legumbres, por ejemplo, suministran al suelo un nitrógeno que las plantas vecinas pueden aprovechar. Ciertas plantas proporcionan elementos disuasorios naturales contra las plagas de insectos. Las plantas altas sirven de soporte a las trepadoras. Las plantas bajas proporcionan sombra a las raíces de las plantas cercanas. Hay plantas que se complementan en sus necesidades, hay plantas que se ayudan mutuamente, hay plantas que confunden los insectos, y hay plantas que luchan directamente contra las plagas, como es la Tagetes o Calendula contra los nematodos del suelo. Por todo ello es recomendable plantar alrededor de la huerta una fortaleza de Tagetes, y plantar ajo mezclado por todas partes.

Por ejemplo: Se eligen los primeros 7 ejemplos (véase arriba) y se planta en líneas con 50 cm de distancia entre ellas. Primero se marca arriba y abajo con estacas, partiendo del borde de la huerta. Para marcar/sembrar/plantar se utiliza una cuerda. Alrededor de está huerta se siembra o planta tagetes mezclado con perejil.

Enterobacterias

Enterobacterias

La familia Enterobacteriaceae está constituido por más de 20 géneros y más de 100 especies, es decir, por un gran grupo heterogéneo de bastoncillos Gram Negativos, cuyo hábitat natural es el tubo intestinal del hombre y los animales, en las heces existen aproximadamente 10⁹ g/heces.

Las enterobacterias son aerobias facultativas o anaerobias facultativas, fermentan gran variedad de carbohidratos, poseen una estructura antigénica compleja y producen diversas toxinas y otros factores de virulencia. Pueden ser móviles o inmóviles. Cuando son móviles, la mayor parte presentan flagelos peritricos. Estas bacterias se pueden llamar coliformes.

Clasificación

·         Su capacidad de reducir los nitratos a nitritos

·         Por fermentar la glucosa con producción de ácido o ácido y gas.

·         No requieren aumento de las cantidades de Cloruro de Sodio (NaCl) para crecer.

·         Son negativos a la oxidasa.

·         Se recurre a muchas pruebas bioquímicas para distinguir entre las especies que componen este grupo.

Morfología e Identificación

Las enterobacterias son bastoncillos Gram Negativos cortos que pueden llegar a formar cadenas.

Agar Chocolate: es un medio de cultivo enriquecido y no selectivo. Es una variante del agar sangre. Contiene globulos rojos que han sido lisados (destruidos) a 56°C. Se usa para el crecimiento de bacterias del sistema respiratorio. Ejemplo; Haemophilius Influenzae

Punto Hidroscopico: es el que define la capacidad inicial de la absorción de agua. Es el grado de humedad que corresponde al agua.

Los medios diferenciales permiten una identificación preliminar a la vista de la morfología y la colonia y de alguna reacción Bioquímica.

Las bacterias entéricas son habitantes de los intestinos de los animales, en ciertos casos son causantes de patologías graves. Las baterías de este grupo intervienen de forma activa en el tratamiento de aguas residuales.

Antibiograma

Elaboración de un Antibiograma

OBJETIVOS

·         Determinar la sensibilidad a diversos antibióticos de un determinado microorganismo

·         Comprender el concepto de antibiótico y su especificidad  de acción sobre determinadas bacterias.

·         Conocer el concepto de cepa sensible y  resistente.

·         Entender el concepto de halo de inhibición.

·         Ser consciente de la importancia de la higiene y el cuidado en la manipulación de materiales biológicos.

·         Comprender la importancia de la eliminación de los  residuos orgánicos

·         Conocer el instrumental de laboratorio necesario en microbiología y los procedimientos para su utilización

MATERIALES

·         Jeringa con suero fisiológico estéril (solución de Nacl  al 0,9%)

·         Placa “problema” (cultivada en agar-sangre)

·         Discos de diferentes tipos de antibióticos (4-6 tipos distintos)

·         Tubos de ensayo

·         Placa agar-sangre

·         Regla milimetrada

·         Rotulador de vidrio

·         Cinta adhesiva

·         Pinzas finas

·         Contenedor con lejía

·         Torunda estéril

·         Tablas para determinación de resistencias

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 
 

·         No se puede tocar nada que vaya a tomar contacto con la muestra biológica con las manos (depresor, asa de siembre, torunda,...) para evitar contaminaciones.

·         Una vez utilizado este material ha de ser eliminado en un  contenedor especial. Estos contenedores serán llevados posteriormente a una planta de tratamiento de residuos biológicos, donde serán incinerados.

·         Todos los materiales o muestras tomadas deben estar perfectamente identificados: nombre, grupo, fecha e indicativo del tipo de muestra.

·         Las placas sembradas deben sellarse con cinta adhesiva al finalizar para evitar su contaminación o la nuestra.

·         Al acabar la práctica, se deben lavar bien las manos.

Siembra en césped del microorganismo problema

·         Tomamos con una jeringa una pequeña cantidad de suero fisiológico estéril (2-5 ml) y lo vertemos en un tubo de ensayo.

·         A  partir de la placa problema, que contiene colonias del  microorganismo cuya  sensibilidad a los antibióticos queremos determinar, tomamos  una muestra  SUPERFICIAL de  UNA SOLA COLONIA con  un asa de  siembra.

·         Introducimos  el asa de siembra con la muestra en el tubo  y agitamos el asa  para realizar  una suspensión de las bacterias en el suero  fisiológico. Al acabar echamos al  contenedor de residuos el asa de  siembra.

·         Introducimos un  hisopo estéril en el tubo,  mojar el  hisopo estéril en la  suspensión. Escurrir el exceso de líquido contra las  paredes del tubo de  ensayo. Tapar el tubo e inocular la placa pasando muy  suavemente por la  superficie de la placa agar-sangre nueva. En esta ocasión  realizaremos una  siembra en césped, es decir, por toda la  superficie de la placa,  para conseguir que crezca bacterias de modo masivo (no  interesa aislar  bacterias como en la práctica del frotis faríngeo). Es  importante que la  siembra sea SUPERFICIAL, sin profundizar en el medio de  cultivo.  (se puede Inocular dos veces más en ángulos de 60°)

·         Se tapa la placa  y se rotula indicando en el nombre, grupo y fecha y marcando con  una A la tapa (Antibiograma) 

Colocación de los discos de antibiótico

Tomando ahora con las pinzas - NUNCA CON LAS MANOS- un disco de cada uno de los antibióticos que se facilitan (cada disco es un papel de filtro que contiene una suspensión de uno varios antibióticos a la  concentración terapéutica). 
 
Se deposita el disco suavemente sobre la placa, sin tocar  la superficie con las pinzas. es muy importante que el disco contacte con el  medio de cultivo en un unico sitio. Realizamos la misma operación con los otros  cinco antibióticos, colocando los nuevos discos separados de los anteriores,  formando un hexágono.

 Incubación y observación. Se llevan las placas a  incubar a 37°C (temperatura corporal) durante 24 horas. tras este periodo se  recogen las placas y SIN ABRIR se observa el crecimiento  bacteriano. 

 Medición del halo de inhibición. Porla parte trasera de la placa incubada mediremos el  diámetro de los halos de 
inhibición que se han formado alrededor de los discos  de antibiótico a los que la bacteria “problema” es sensible. 
Anota  los datos en la representación de la figura 2,  indicando con un número del 1 al 6, el antibiótico colocado en el disco y  dibujando la presencia o ausencia de halos y su tamaño en mm.

Con ayuda de las tablas que se te proporcionan determina  si la bacteria es sensible (S) o resistente (R) a cada antibiótico y anótalo en la tabla, en las columnas correspondientes.

Conceptos Básicos

·         Desinfección: este proceso reduce en 3 a 5 log, la contaminación microbiana inicial. Produce la destrucción de agentes infecciosos o contaminantes presentes en objetos y ambientes.

·         Esterilización: proceso validado usado para obtener un producto libre de todo microorganismo en estado latente o activo, causante de enfermedades infecciosas.

·         Antisepsia: se define como el empleo de medicamentos para eliminar bacterias y microorganismos infecciosos. Son sustancias capaces de destruir y eliminar microorganismos causantes de una infección producida por bacterias (Faringitis, Bronquitis, Otitis, Neumonía.).

Condiciones de Asepsia

1.      Lavado de manos.

2.      Lavado y desinfección de mesa.

3.      Forrar la mesa con papel estraza.

4.      Crear un campo estéril en área de trabajo con un mechero (Fisher).

5.      Flamear asa de platino (Posición perpendicular), procurar hacerlo en la parte alta del mechero.

6.      Antes de retirar el asa, flamear la punta metálica, esperar a que se enfrié.

7.      Flamear la boca de los tubos, matraces o frascos (lo que se esté utilizando).

8.      Después de quitar el algodón de la boca del tubo, nunca dejar sobre la mesa, se toma con el dedo meñique de la mano, siempre trabajando en la proximidad del mechero.

9.      Uso de guantes de latex y cubrebocas (De preferencia el analista con más razón)

Manipulación de la caja

1.      Siempre estarán en posición invertida antes de tomar el inoculo o sembrar.

2.      Se toma la base de la placa con la mano contraria a la que sostiene el asa, dejando la tapa al lado del mechero, todo esto se hace dentro de la zona estéril del mechero, (El área estéril que provoca el mechero tiene un radio de 10 cm).